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Fluo-2最早是由Roger Tsien博士发明的钙离子指示剂Fluo系列之一，目前，Fluo-3和Fluo-4已成熟商品化。然而，Fluo-2在细胞内比Fluo-4要更明亮，主要可能是由于大部分细胞对Fluo-2的加载能力要高于Fluo-4。

Fluo-3成像涉及到钙离子信号通路的多个方面，Fluo-3经常应用在流式细胞术上，如螯合剂光活化、第二信使、神经递质以及细胞水平的药理筛选。Fluo-3在这些应用里之所以能大量运用主要是由于其几个重要特性：Fluo-3可以被氩离子激光器488nm激发，并在与Ca²⁺结合后，发射荧光很明亮的荧光信号。Fluo-4是Fluo-3以两个氟原子取代氯原子的类似物，这一微小的结构变化使得Fluo-4探针在488nm激发光下的荧光信号得到增强，信号稳定持续，可以应用于共聚焦显微镜、流式细胞仪、微孔板读数仪。

Fluo-2、Fluo-3和Fluo-4在与Ca²⁺结合后荧光增强，与紫外激发的探针fura-2和indo-1不同，不会发生光谱漂移。荧光光密度在与Ca²⁺结合后，增强至少100倍。Fluo-2、Fluo-3，Fluo-4和Fluo-8的光谱特性，见附录参考表1.

1. 合适培养基稀释一份染料的DMSO储液(2～5mM)到1～10μM的终浓度，加入非离子型去污剂Pluronic F-127可以协助非极性的AM酯在水溶液中的扩散。可以简单的通过先等体积混合20%(w/V)的Pluronic与DMSO，确保Pluronic在加载到细胞中的工作浓度是0.02%。
   
2. 有机阴离子转运抑制剂probenecid(1～2.5mM)或sulfinpyrazone (0.1～0.25mM)可以添加到细胞培养基中，以减少探针在胞外的脱酯现象。Probenecid和sulfinpyrazone储液基本为碱性，因此在添加到培养基中时需要先调整到与所用培养基匹配的pH。
   
3. 细胞通常可以与AM酯探针在20～37℃条件下孵育20～60分钟，最佳的探针加载浓度、时长与温度需要在实验中具体摸索确定。一般来说为了减少可能的毒性超负荷，只要满足足够的荧光检测强度，选择尽可能低的染料浓度。此外，由于亚细胞结构的分区化特点，AM酯加载技术存在固有的标记问题，这可以通过降低孵育温度来解决。
   
4. 在进行荧光检测之前，细胞应用无指示剂的培养基(允许的话，可以添加阴离子转运抑制剂)充分洗涤，以确保洗去细胞表面的非特异性染料吸附，再另外以新鲜培养基孵育30分钟保证胞内酯酶水解充分进行。这里，可能会有少量的指示剂逸出胞外从而产生背景荧光，可以通过临将上机检测之前，在外培养基中添加抗荧光素抗体，来降低背景。